生殖器疱疹 诊断

　　诊断

　　HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和实验室检查结果而定。有不洁性交史，而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱，易复发等不难诊断。必要时可作疱液涂片，培养、接种、免疫荧光检查。血清免疫抗体测定等，均有助于诊断和确定病毒类型。

　　一、细胞学方法

　　对皮损刮片做Wright-Gemsa （Tzanck试验）或Papanicolaou染色，可检出HSV感染特征的巨细胞包函体，但不能区别HSV感染或水痘 — 带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60%。

　　二、培养法

　　从水疱底部取材做组织培养分离病毒，为目前较敏感、最特异的检查方法，需5-10天，因其技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。

　　三、抗体检测

　　目前最广泛的是HSV-2抗体检测，如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体，具有敏感性，且能区分HSV-1和HSV-2的优点。

　　四、基因诊断

　　（一）用PCR分型检测单纯疱疹病毒

　　PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，标本中含有1fg HSV-DNA就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。

　　1、标本采集和处理

　　（1）标本采集

　　①脑脊液：直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检。如肉眼可见血色，应离心取上清。

　　②羊水及婴儿血清： 同上，应避免溶血。

　　③脑组织： 脑组织尸检、活检标本， 加1ml PBS标本缓冲液研磨后，待检。

　　④眼及皮肤病灶分泌物：用预测（半干）棉拭子直接取患处分泌物， 置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　⑤生殖器（宫颈、阴道、外阴、阴茎）标本：先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　（2）标本处理

　　①预处理：所有液体标本均可直接进行模板制备；可以取100μl标本液，离心5000 r/ min×5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。

　　②模板制备：a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h后，煮沸10 min，离心5000 r/ min×5min，收集上清。 b: 水煮法：沉淀物加100μl蒸馏水，摇均水煮20 min，离心5000 r/ min×5min收集上清。c: 1%Triton X-100裂解法：取采集的标本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d: 5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ min×5min收集上清。e: 如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μl DW溶解待检。

　　2、PCR扩增

　　（1）引物设计。以HSV DNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物，一个上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二个下游特异性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　　）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分别扩增出HSV-1 469bp DNA片段（1981～2359）、HSV-2 391bp片段（1561～1953）：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP3 5 'GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘）。

　　（2）PCR实验体系。取模板10μl： DNAP5 0.5（0.2μmol/L）：DNAP3-1 0.5μl （0.2μmol/L）：DNAP3-2 0.5μl （0.2μmol/L）：4×dNTP 8μl（4×200μmol/L）：10×dNTP 8μl（4×200μmol/L）；10×缓冲液10μl：DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 石蜡油 30μl.。

　　水煮（96℃～100℃）7min

　　加TaqDNA聚合酶1μl;（2.5U）

　　72℃4 min

　　↓

　　95℃40s

　　↓

　　65℃60s → 72℃70s

　　↓　　33个循环

　　70℃4 min

　　3.扩增产物的检测和分析

　　（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙锭（EB）染色5min，于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

　　（2））XhoI酶谱法：取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%琼脂糖凝胶中，70V电泳15～20min，可产生46bp片段带（引物后面）；与正常PCR产物比较，XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。

　　（3）Southern印迹法：PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90 min，转移至硝酸纤维素膜上：80℃烤膜2 h，42℃预杂交（杂交液中）30 min， 加入32p标记HSVP3探针后，42℃杂交过夜；次日用1%SDS/ PBS pH7.2， 42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2， 42℃洗15min; 膜置X线暗盒内放射性自显影12～15h， 显影为阳性， 不显影为阴性。

　　（二）套式PCR

　　套式PCR（nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR）是通过“外侧”、“内侧”两对引物，即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物，这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性。但该方法不能分型，能100%检出HSV-1，50%检出HSV-2，应改进分型检测HSV，更好地在临床应用和基础研究中推广应用。

　　1、标本处理：

　　（1）标本采集同上

　　（2）DNA 制备：①脑脊液：取100μlCSF 水煮15min，加入250μl无水乙醇，放-30℃10 min;离心10000g30 min，去上清，30℃干燥后，加入10μl DW; ②脑组织细胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10 min;取上清加入等体积酚一氯仿（V/V），轻摇10 min，离心10000r/ min×10 min;取水相，加入250μl DW溶解。

　　2、PCR扩增

　　（1）引物设计：选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。

　　NP-PCR 的引物和探针序列

　　“外”引物

　　BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43

　　BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239

　　“内引物”

　　BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79

　　BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188

　　探针

　　BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125

　　（2） PCR实验体系和程序： 反应体积为50μl;模板10μl;BJHSV1.1 0.5μl（0.2pmol/L）； BJHSV1.2 0.5μl（0.2pmol/L）； 10×缓冲液5μl; 4×dNTP 4μl（4×200mmol/L）；DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环20次， 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增， 先95℃变性2min，循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环30次后，72℃延伸5 min;。

　　（3） 扩增产物分析：

　　① 琼脂糖凝胶电泳染色法：

　　取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中， 70V电泳15-20min，溴化乙锭染色5min，于紫外灯下观察结果，在溴酚兰后面有一条，或二条亮红条带为阳性结果， HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

　　② Southern印迹法：

　　PCR产物20μl 经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32P标记HSV探针后，42℃杂交过夜，次日用1%SDS/PBS pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min;膜置X线暗盒内，放射性自显影12-15h，显影为阳性，不显影为阴性。

　　（三）、聚合酶链反应—酶谱法（polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC）

　　具有经济广泛等特点；不仅能一次性分型检测HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四种病毒，而且方法本身快速、方便、无放射线损伤，易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1，灵敏度高，能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSV DNA阳性结果，并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的变异性，会出现酶切点突变丢失现象，从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。

　　1. 标本处理

　　（1）标本采集，方法同上。

　　（2）DNA模板制备：每份标本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h;

　　加入等体积的酚—氯仿（v/v）轻摇10min，离心1000r/min×5min;取水相加入500μl（2.5倍体积）无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA，离心15000r/min×5min，吸去液体，30℃干燥后，加蒸馏水25μl溶解， 待检。

　　2. 引物设计：

　　P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

　　P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

　　（1）PCR实验体系：

　　反应体积100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl（10pmol/L） ，P2 0.5μl（10pmol/L）； 4×dNTP 4μl（4×200mmol/L）； 10×缓冲液10μl， DMSD 5μl， DW 65μl， 循环参数为94℃60s; 60℃60s; 72℃60s;循环40次72℃延伸4min。

　　（2）扩增产物检测与酶切分型。

　　①第一步电泳鉴定： 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液，加入2%琼脂糖凝胶板，70V电泳（5-20min）加EB染色5min后，紫外灯下观察，可初步鉴定扩增产物大小。

　　②酶切分析：分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中，加入50μl无水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解，加入SmaI或BamHI 50U于相应Eppendorf 管内，37℃作用1h。

　　③第二步电泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液，加到2%琼脂糖凝胶中，70V电泳，15-20min后， EB染色5min，与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察， 结果如下：

　　PCR-EC法检测四种病毒结果

　　病毒型号靶片段SmaIBamHI

　　HSV1518bp476bp+42bp

　　HSV2518bp—225+293bp

　　EBV524bp100bp+424bp277bp+247bp

　　CMV589bp不需酶切，第一步电泳就可以区分

　　（四）用RT-PCR检测单纯疱疹病毒

　　RNA的聚合酶链反应（RNA-PCR），可能通过检测HSV不同期的RNA，这不仅可诊断HSV感染，而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。

　　RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应（RT）产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此，RNA-PCR也可称为RT-PCR。

　　1、标本处理：

　　组织块细胞总RNA提取，取100mg组织标本，加1ml硫氰酸胍变性液，于匀浆器中，室温研磨均匀后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L（pH4.0）NaAc， 1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀， 用力振摇10s， 置冰浴15min。10000g4℃，离心20min，取上清水相（上层DNA、下层DNA和变性蛋白质）加入等体积异丙醇置-20℃1h， 沉淀RNA。离心 15000r/min×10min，弃上清， RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解， 再加0.3ml异丙醇沉淀， -20℃1h， 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min， 去上清， 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次， 真空干燥……加10μl TE缓冲液（pH7.4）溶解，低温保存备用。临用前冰浴溶解。

　　2、PCR扩增：

　　（1）引物设计： 选择HSV-1ICPO基因（极早期）为检测靶基因。设计2个引物，

　　P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′

　　P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。

　　1个探针：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

　　（2）PCR实验体系： 总反应体积为50μl，模板10μl （0.25-1.0μg）P1 1μl （20pmol/L）；P2 1μl （20pmol/L）； 4×dNTP 4μl（200μmol/L）； 10×缓冲液5μl; AMV（逆转录酶） 2μl （50U）； DW 26μl; 循环参数， 94℃变性2min后 94℃50s，60℃60， 72℃60s，循环40次后72℃延伸5min。

　　3、扩增产物的鉴定：

　　（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液，混匀后加样2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15-20min，EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。

　　（2）Southern印迹杂交法：用32P标记的特异性探针检测PCR产物，方法同上。

　　总之，在HSV感染性疾病的临床诊断中，PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测，远较DNA探针敏感，并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此，PCR无论是作为基础研究手段，还是作为临床检验诊断方法，均具有广阔的前景。

　　五、病理组织学诊断

　　细胞内水肿，基底层形成大水疱，病灶周围有多核巨细胞浸润，特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间。

　　1.原发性GH

　　（1）潜伏期：为2～7天，常为3～5天。

　　（2）好发部位：男性多发生于龟头、冠状沟、尿道口、阴茎体及阴囊。女性好发于外阴、阴道及宫颈。两性均可见于肛周、大腿及臀部。

　　（3）皮损形态及演变：患处先有烧灼感，随即出现多个群集的红色斑丘疹，并迅速变成小水疱。疱液起初清亮，以后渐变为脓性。水疱易破溃，形成糜烂或浅溃疡，伴明显疼痛。之后结痂而愈，病程约2～4周。

　　（4）全身症状：发病前或发病时可有全身症状，如发热、头痛、全身不适、颈项强直和骶2～4段感觉异常，或有排尿困难和白带增多。几乎所有患者均可伴腹股沟淋巴结肿大及压痛。

　　2.复发性GH

　　约在原发性GH痊愈后1～4个月发生。首次HSV-2感染后1年内近60%的患者复发，第1年内可复发4～6次，以后复发次数减少。eves等发现在生殖器感染者中，HSV-1感染者复发率为14%，而HSV-2感染者则有60%复发。

　　复发性GH患者可有上述激发因素，或有前驱症状，全身症状较轻，复发部位多在原处，病程也较短，皮损约经10天左右即消退。由于病损反复发作，难以控制，患者易出现精神负担和性功能障碍，甚至发生抑郁症等。但其损害与原发性者甚为相似。

　　3.特殊型GH

　　（1）男性同性恋者GH：本病仅次于淋球菌引起的肛门直肠炎。有人从62例有肛门直肠症状但淋球菌检查阴性的男性同性恋者中，29%检出了HSV-2。临床表现多为严重的肛门、直肠疼痛，其他症状为便秘、肛门内有分泌物、里急后重和发热等。部分病人肛周有水疱或溃疡。

　　（2）孕妇和新生儿GH：孕妇患GH后，其后果严重。对妊娠GH患者HSV-2携带者来说，最重要的是传染给新生儿。当产道内存在HSV-2时，可有40%～60%的新生儿遭受感染，感染严重者可致死亡。

　　在妊娠早期，患GH的孕妇可影响胎儿，导致流产或死胎。新生儿的先天性感染，出生时可出现带状分布的疱疹、癫痫发作、出血倾向与肝脾肿大。如通过产道感染或胎膜早破而发生逆行感染时，轻者出生后数日至数周可无临床症状，早期可仅有吃奶较差、兴奋，以后可发生病毒血症或疱疹性脑炎，重者发生播散性HSV感染，可出现高热、呼吸困难、出血及中枢神经系统病变，预后不良。

　　因此，妊娠足月患GH者，如时间允许，应每周从阴道及子宫颈取材，检查有无病毒感染，若细胞学或病毒培养阳性而羊膜尚完整，或破裂后不足6h，建议剖宫产，以避免胎儿经阴道分娩而发生新生儿HSV感染。

　　HSV-2感染与宫颈癌：有证据表明，生殖器HSV-2感染可能与宫颈癌的发生有关。血清流行病学检查发现，宫颈癌患者血清中抗HSV-2抗体较对照组妇女明显增高。Nahmias等发现，GH患者发生宫颈非典型增生者为对照组的2倍，而发生原位癌者则为对照组的8倍。近年来研究证明，患侵袭性宫颈癌和癌前期病变的妇女宫颈脱落细胞中，HSV-2抗原阳性率明显高于对照组，这种HSV-2抗原位于肿瘤细胞的胞质内，提示为肿瘤细胞表达的病毒抗原。有人发现，宫颈有高度非典型增生、原位癌及鳞状细胞癌者的活检组织中，用间接免疫荧光染色可发现其中的HSV-2抗原。应用DNA-RNA原位杂交技术在宫颈癌和癌前期组织中67%可发现HSV-2特异性mRNA。Frenkel等在宫颈癌组织中检出HSV-2的DNA。还有作者从手术切除后经放射的宫颈癌病变组织中分离出了HSV-2。

　　HSV-2感染与HIV感染 与其他生殖器溃疡性疾病一样，GH增加了HIV感染的危险性。HSV感染是HIV感染的辅助因子。在HIV感染者尤其是HIV感染的同性恋者中，HSV-2感染率更高，且GH的并发症多而严重。在AIDS患者中，耐阿昔洛韦（无环鸟苷）的HSV毒株感染多见。

　　根据病史、症状和皮肤或黏膜表现，一般不难作出诊断。必要时可进行实验室检查，以明确病原体。

　　中医病机和辨证 本病多因体内蕴热，外感毒邪，热毒相结，肝胆二经湿热下注而生；或因肌肤虚弱，邪毒留肤，遇热即发。

　　中医辨证分型

　　1.湿热下注型

　　主证：患处水疱、糜烂、痒痛交作，大便秘结，小便短赤。舌红，苔黄腻，脉弦滑数。

　　辨证：湿热下注，外感毒邪。

　　2.肝肾亏损型

　　主证：病情反复发作，兼有心烦寐少，腰酸头昏，食少乏味，口干咽燥。舌质淡，脉沉细。

　　辨证：清热化湿，养肝滋肾。

　　鉴别

　　主要与硬下疳，软下疳鉴别：硬下疳为单个质硬的溃疡，无疼痛感，无复发史，实验检查USR（+）或RPR（+），梅毒螺旋体可见。软下疳为质软的溃疡，局部虽有疼痛感但无复发史，实验检查链杆菌阳性。

　　1.固定型药疹 有药物过敏史，发疹前有用药史，每次发病位固定且不限于外阴部，其他的皮肤、黏膜交界处也有损害，皮损主要为暗红斑上有厚壁水疱或大疱。

　　2.Behcet综合征 可首先出现口腔或外生殖器溃疡，针刺试验阳性，以后可伴虹膜睫状体炎及四肢结节性红斑。

　　3.梅毒硬下疳 潜伏期2～4周，局部硬结、溃疡，无自觉症状，苍白螺旋体和梅毒血清反应阳性。

　　4.软下疳 发病前2～5天有性乱史，损害为外阴部溃疡，基底软，伴疼痛与触痛，单侧腹股沟淋巴结肿大、触痛，可形成溃疡并排脓，可检出Ducrey嗜血杆菌。

　　其他生殖器部位皮肤病如接触性带状疱疹、白塞病。脓疱病有时与生殖器疱疹相似，可以从病史及检查方面相区别。